實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/font>
1、 熟悉酶免疫技術(shù)基本原理和方法、免疫熒光技術(shù)的基本原理。
2、 了解酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（間接法）的基本過程及其作用。
目前應(yīng)用zui多的免疫酶技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），它是使抗原或抗體吸附于固相載體，使隨后進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)均在載體表面進(jìn)行，從而簡(jiǎn)化了分離步驟，提高了靈敏度，即可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。實(shí)驗(yàn)方法包括間接法、夾心法及競(jìng)爭(zhēng)法。
為了檢測(cè)抗原可用夾心法。將特異性抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯制成的小管、小盤或小孔）上，然后加被測(cè)溶液，倘樣品中有相應(yīng)抗原，則與抗體在載體表面形成復(fù)合物。洗滌后加入酶標(biāo)記的特異性抗體，后者通過抗原也結(jié)合到載體的表面。洗去過剩的標(biāo)記抗體，加入酶的底物，在一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)酶催化產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的量與溶液中抗原含量成正比，可用肉眼觀察或分光光度計(jì)測(cè)定。
為了檢測(cè)抗體可用間接法。使抗原吸附于載體上，然后加入被測(cè)血清，如有抗體，則與抗原在載體上形成復(fù)合物。洗滌后加酶標(biāo)記的抗球蛋白（抗抗體）與之反應(yīng)。洗滌后加底物顯色，有色產(chǎn)物的量與抗體的量成正比。（見圖5-1）
常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP），相應(yīng)的底物分別是鄰苯二胺（OPD）和對(duì)硝基苯磷酸鹽，前者呈色反應(yīng)為棕黃色，后者為藍(lán)色。可用目測(cè)定性，也可用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度（OD）值以反映抗原含量。
實(shí)驗(yàn)六 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELASA）
ELASA是一種用酶標(biāo)記抗原或抗體，在固相反應(yīng)板上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的方法。常用于檢測(cè)體液中的微量抗原和抗體，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、容易判斷等優(yōu)點(diǎn)。其檢測(cè)方法、注意事項(xiàng)、結(jié)果分析等詳見檢測(cè)試劑的說明書。本實(shí)驗(yàn)以雙抗體夾心法為例檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原介紹如下：
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要求了解試驗(yàn)原理，試驗(yàn)方法及結(jié)果分析。
實(shí)驗(yàn)材料
1．標(biāo)本：待檢人血清
2．試劑：酶標(biāo)抗體（抗HBs）、HBsAg陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照、洗滌液、顯色劑A、B，終止液
3．器材：已被抗體包被的微量反應(yīng)板（48孔）、微量移液管、酶標(biāo)儀等。
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法
1．在微量反應(yīng)板每孔加入待檢標(biāo)本50μl，設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照各2孔，每孔加入陽(yáng)性（或陰性）對(duì)照各1滴，并設(shè)空白對(duì)照1孔。
2．每孔加入酶結(jié)合物1滴（空白對(duì)照除外），充分混勻，封板，置37℃孵育30分鐘。
3．棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干。
4．每孔加顯色劑A液、B液各1滴，充分混勻，封板，置37℃孵育15分鐘。
5．每孔加終止液1滴，充分混勻。
6．用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與評(píng)價(jià)
樣品OD值≥2.1陰性對(duì)照平均OD值，判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。陰性對(duì)照OD值低于0.05作0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算。
